大鼠基质金属蛋白酶-2（MMP-2）酶联免疫分析（ELISA）
　　
　　试剂盒使用说明书
　　本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆,
　　上清及相关液体样本中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的含量。
　　实验原理：
　　本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠基质金属蛋白酶2（MMP-2）水平。用纯
　　大鼠基质金属蛋白酶2（MMP-2）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔
　　次加入基质金属蛋白酶2（MMP-2），再与HRP标记的MMP-2抗体结合，形成抗体-
　　酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成
　　并在酸的作用下转化成**终的黄色。颜色的深浅和样品中的基质金属蛋白酶2（MMP
　　正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人
　　基质金属蛋白酶2（MMP-2）浓度。
　　试剂盒组成：
　　试剂盒组成48孔配置96孔配置保
　　说明书1份1份
　　封板膜2片（48）2片（96）
　　密封袋1个1个
　　酶标包被板1×481×962-8℃保
　　标准品：450μg/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保
　　标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保
　　酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
　　样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
　　显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
　　显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
　　终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保
　　浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保
　　样本处理及要求：
　　1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收
　　清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
　　2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，
　　20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该
　　离心。
　　3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存
　　中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
　　4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-30
　　分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，
　　浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20
　　钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
　　5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备
　　用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器
　　将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待
　　检测，其余冷冻备用。
　　6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上
　　进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
　　7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
　　操作步骤：
　　1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在**、第二孔中分别加标
　　准品100μl，然后在**、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从**孔、第二
　　孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，
　　混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔
　　中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各
　　取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混
　　匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准
　　品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，
　　浓度分别为300μg/L，200μg/L，100μg/L，50μg/L，25μg/L）。
　　2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
　　品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样
　　品**终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混
　　匀。
　　3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
　　4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
　　5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
　　重复5次，拍干。
　　6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
　　7.温育：操作同3。
　　8.洗涤：操作同5。
　　9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
　　15分钟.
　　10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
　　11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止
　　液后15分钟以内进行。
　　注意事项：
　　1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
　　用完，板条应装入密封袋中保存。
　　2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
　　3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间**好
　　控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
　　4．请每次测定的同时做标准曲线，**好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值
　　大于标准品孔**孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计
　　算时请**后乘以总稀释倍数（×n×5）。
　　5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
　　6．底物请避光保存。
　　7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
　　8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
　　9．本试剂不同批号组分不得混用。
　　10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
　　计算：
　　以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
　　在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD
　　值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
　　倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
　　准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
　　代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
　　倍数，即为样品的实际浓度。
　　
　　
　　（此图仅供参考）
　　试剂盒性能：
　　1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
　　2.批内与批见应分别小于9%和11%
　　检测范围：
　　20μg/L-400μg/L
　　
　　保存条件及有效期：
　　1.试剂盒保存：；2-8℃。
　　2．有效期：6个月

　　 资料来源于：//www.yfswbio.com/yfbio-Article-88485/